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HPLC法測定谷物中黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

發布時間:2011/9/22      點擊次數:12262

HPLC法測定谷物中黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2含量

 

   

     用一種快速方便的 真菌毒素多功能凈化柱處理樣品,然后用液相色譜對谷物中黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2進行測定。樣品經乙腈-體積比8416)提取,提取液通過真菌毒素多功能凈化柱凈化、濃縮,三氟乙酸(TFA)柱前衍生,C18色譜柱分離,熒光檢測器檢測,外標法定量。對添加兩個濃度黃曲霉毒素的玉米樣品進行加標回收實驗,4種毒素的回收率均在90.44%101.23%之間,B1、G1、B2、G2的zui低檢測限分別為2.0、1.0、0.5、0.5ng/kg。實驗結果表明,此法不僅定量準確,精密度高而且操作極為方便。

    

 

真菌毒素對糧食飼料的污染是一個性的問題,我國因是農業大國和人民以谷物為主食的飲食習慣,使真菌毒素的污染問題顯得更為突出。黃曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一,對世界上30多個國家和地區進行的調查表明,危害程度排在*位的是黃曲霉毒素。它是由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產生的一組結構類似的化合物[1],均為二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。雖然黃典霉毒素(AF)的衍生物有20多種,目前已分離鑒定出的AF包括:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12種,但天然污染糧油食品的AFB組和G組兩大類,即AFB1、AFB2、AFG1AFG2。黃曲霉毒素的毒性,致突變及致癌作用已得到明確證實。它由強到弱的順序依次為AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。 歐盟的黃曲霉毒素的*AFB14μg/kg。

    霉菌毒素的檢測定量一直是個難點,目前黃曲霉毒素檢測的國標方法有薄層色譜法、酶聯免疫法、免疫親和柱凈化液相色譜法。薄層色譜法操作繁瑣、污染大、定量差、耗時長;而酶聯免疫法雖操作簡單、靈敏度高,但特異性差;免疫親和柱液相色譜法是柱后衍生法,它對于高黃曲霉毒素含量的樣品偏差較大。且柱后衍生不普及,給使用帶來不便。本文所述方法用真菌毒素多功能凈化柱快速凈化,液相柱前衍生法簡單方便,靈敏度和特異性高,又能避免氯仿等有毒試劑的使用,是一種值得推廣的好方法。這種方法,在上不少試驗室已得到確認,還被作為AOAC的*方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

    乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、疊氮化鈉(分析純)、去離子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱、液相色譜儀、2475熒光檢測器。

1.2 標準品的準備

    標準品包括了黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2各單一標準液和混合標準液,溶劑為乙腈,黃曲霉素混合標準液的濃度為2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。單一標準液用來確定各自的保留時間,具體工作用混合標準液是將所提供標準液稀釋10倍,用微量注射器分別取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀釋標準液具體濃度為200ng/mlB1、G1;50ng/mlB2、G2),和樣品一樣蒸干,用三氟乙酸衍生,定容于0.2ml流動相,故所得進針的濃度分別是:B1、G15.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml;G2、B21.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。

1.3 樣品

    實驗所用樣品包括玉米、小麥等,取代表樣品5kg,粉碎,充分混合均勻,四分法縮至500g。因霉菌毒素分布不均勻,充分混合非常重要,必要時取樣量加大(有地方建議取15kg)。

1.4 樣品的提取和凈化

    使用粉碎機將樣品研細,稱取25g研細樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水(體積比8416)溶液。在旋轉震蕩器上震蕩1h。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中。轉移8ml樣品提取液通過PuriToxSR160 菌毒素多功能凈化柱,推出大約4ml的凈化液(具體過程見圖1),轉移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶 。在水浴60℃條件下用氮氣吹干。

 

1.5 柱前衍生及液相色譜條件

    向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸,立即旋緊蓋子。渦旋30s,在40℃烘箱中衍生15min,室溫下氮氣吹干混合物,用200μl-乙腈(體積比8515)溶解殘余物并渦旋30s,將其轉移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min,把已經制備凈化好的150μl樣品液轉移到HPLC樣品瓶,進樣25μl。液相色譜條件見表1。

 2 結果與討論

2.1 4種黃曲霉毒素的分離情況

    50μl黃曲霉毒素混標工作溶液濃度為B1、G1 200ng/ml;G2、B2 50ng/ml)于棕色瓶內,吹干,衍生,流動相定容,經液相色譜分離得出的標準色譜分離見圖2。黃曲霉毒素G1、B1的濃度為50ng/mlG2、B2的濃度為12.5ng/ml。

 2.2 標準曲線及回歸方程

    按實驗方法進行測定,4種黃曲霉毒素的標準曲線、回歸方程及檢出限(按3倍信噪比計算)的測定結果見圖3和表2。

 2.3 樣品的加標回收實驗

    取玉米樣品一份,分別做兩個濃度的加標回收實驗。具體做法是:取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl 25μl黃曲霉素混合標準液(1 000ng/ml黃曲霉素B1、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2、G2)作為加標。經過和樣品一樣的處理,得出其zui后的理論濃度見下式。

    B1、G1濃度:(0.010ml×1 000ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=12.5ng/ml;

(0.025ml×1 000ng/ml/8ml×(2ml/0.2ml)=31.25ng/ml。

    B2、G2濃渡:

(0.010ml×250ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=3.125ng/ml;

0.025ml×250ng/ml/8ml×(2ml/0.2ml)=7.812 5ng/ml。

 2.4 精密度實驗

    按實驗方法進行樣品處理,對同一樣品連續測定5次。

 2.5 樣品調查

    從市面上抽取10份玉米樣品,按此實驗方法進行處理,結果為未檢出黃曲霉毒素。此方法簡便易行、快速準確、靈敏度高、檢測限低,適合大批量檢測,值得推廣


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